画浊颗粒治疗非酒精性脂肪肝大鼠模型的实验研究
随着人们生活水平的提高、生活方式的改变, 非酒精性脂肪肝病（NAFLD）也呈升高的趋势，大量研究显示NAFLD患者具有肥胖、脂代谢紊乱、高血压和糖代谢异常等胰岛素抵杭（IR）的特征[1][2]。由于对NAFL缺乏可靠的特异性治疗方法，目前多采用综合治疗策略，主要包括：生活方式干预、减轻体重和调脂治疗。西医近年来应用胰岛素增敏剂，如二甲双胍、噻唑烷二酮类药物，抗氧化治疗，显示了一定的疗效。
中医认为NAFLD系特异性体质的人群长期饮食失常（如过食肥甘）与体力活动减少等共同作用使人体气化失常、浊毒积聚，进而阻碍气血运行，影响脏腑功能所致。宜从浊毒论治，解毒化浊、调气活血。所以选用具有清热燥湿,泻火解毒的黄连、黄柏，消积化浊，健运脾胃的鸡内金、山楂，活血化瘀的丹参和健脾疏肝的枳壳等组方。由此六味药等组成的化浊颗粒在临床试用后具有良好的调节血脂、血糖异常和改善胰岛素抵抗（IR）等作用。本实验旨在应运已被临床证实具有明显降低血脂、改善胰岛素抵抗（IR）、提高NAFLD患者生活质量的中药制剂化浊颗粒 ，通过研究其对非酒精性脂肪肝病大鼠模型的干预来探讨中药改善NAFLD或IR的作用机理。为开发新药提供理论依据。
一、材料与方法
1.研究对象
选SPF级Wistar大鼠50只，雌雄各半，体重约为200�20克，由甘肃中医学院SPF级动物实验中心提供。基础饲料适应性喂养1周后，将50只大鼠按体重、性别重编号，以随机数字表法抽取8只为A组：空白组，用基础饲料喂养（总热量15.335J/g，碳水化合物热卡占53%，脂肪热卡占9%，蛋白质热卡占20%）；其余42只均喂以高脂饲料[3]（胆固醇2%，猪油10%，基础饲料88%）。两组均在SPF实验室喂养，自由饮水。至第8周末,大鼠禁食12h，随机处死高脂饲料组大鼠2只（雌雄各一只），取出肝脏进行肝组织切片HE染色以确认模型制备成功。剩余的40只高脂饲料组大鼠按随机数字表，分为B组：模型组10只；C组：罗格列酮组10只；D组：化浊颗粒高剂量组10只；E组：化浊颗粒低剂量组10只。B、C、D、E各组均继续喂以高脂饲料4周，实验期间观察体重、饮食及尿量。
2.实验方法
对造模成功的模型对照组，罗格列酮治疗组，化浊颗粒高剂量治疗组，化浊颗粒低剂量治疗组四组及空白组，第8周，各组动物分别灌胃药物或生理盐水，每日一次，给药按人与大鼠体表面积比折算成等效剂量。空白组、模型组分别每日灌胃等剂量的生理盐水；罗格列酮组每日灌胃罗格列酮溶液（0.36mg/kg）；化浊颗粒高、低剂量治疗组分别每日灌胃等体积化浊颗粒溶液（2.025g/kg和0.675g/kg）。
2.1第12周末，称重，隔夜禁食12h，脱臼处死所有大鼠，股动脉采血，以3500 r/min离心10 min，分离血清，于-25℃冰箱内保存以检测TC、TG、FFA、FPG、FINS及TNF-α含量。并计算IRI（HOMA-IR)：HOMA-IR=(FPG�FINS)/22.5。并迅速取出肝脏，称量其湿重，以用来计算其肝脏指数，然后从每只大鼠肝脏左叶切取两部分，一部分放置-70℃低温冰箱保存备用，一部分用4%甲醛固定以作病理组织检查用。
2.2 检测：FPG、TG、TC在ALCYON300型全自动生化分析仪上测定；FFA按酶比色法分析试剂盒说明书测定； FINS及TNF-α水平，按放免分析试剂盒说明书测定。
2.3 统计学处理：采用SPSS16.0统计软件处理。技术资料所有数据用 �s 表示。组间均数比较采用单因素方差分析及配对T检验，P＜0.05或P＜0.01为有统计学意义。
二、结 果
1.化浊颗粒对NAFLD大鼠体重和肝脏指数的影响
由表1可以看出，经化浊颗粒高剂量组治疗后大鼠体重降低，与治疗前有显著性差异（P<0.01），其余各组治疗后体重均增高。化浊颗粒组，罗格列酮组与模型对照组比较，肝指数均降低，都具有统计学意义（P＜0.01）；化浊颗粒高剂量组与罗格列酮比较无统计学意义（P＞0.05）。
表1 化浊颗粒对非酒精性脂肪肝病大鼠体重和肝指数的影响 ( �s)
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组别
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动物数量
（N）
|
体重（Weight，g）
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肝指数
（%）
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治疗前
|
治疗后
|
|||
|
空白对照组
|
8
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324.21�77.64
|
340.54�85.47
|
3.03�0.11
|
|
模型对照组
|
9
|
343.28�96.23
|
358.8�100.74
|
4.78�0.17*
|
|
罗格列酮组
|
9
|
336.30�76.83
|
354.21�76.94
|
3.80�0.12△
|
|
化浊颗粒高剂量组
|
8
|
333.70�68.61
|
329.88�67.46*
|
3.81�0.13△
|
|
化浊颗粒低剂量组
|
8
|
324.79�73.52
|
350.63�88.64
|
4.21�0.16△▲
|
注：与治疗前相比*P<0.01。与空白组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01；与罗格列酮组比较▲P <0.01。
2.化浊颗粒对NAFLD大鼠血脂的影响
由表2可以看出，经治疗后化浊颗粒高、低剂量组、罗格列酮组与模型组比较，大鼠血清TG均有显著性差异（P＜0.01或P<0.05），说明各药物组均治疗有效；化浊颗粒高剂量组与罗格列酮组降低TG作用相当，均优于化浊颗粒低剂量组。与模型组比较，化浊颗粒高剂量组和罗格列酮组血清TC均有统计学意义（P＜0.01或P<0.05），而化浊颗粒低剂量组无显著性差异（P>0.05），说明化浊颗粒低剂量组在降低TC方面效果不佳。
表2 各组大鼠间TG、TC比较（ �s）
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组别
|
动物数量
（N）
|
TG
(mmol/L)
|
TC
(mmol/L)
|
|
空白对照组
|
8
|
1.338�0.224
|
3.125�0.324
|
|
模型对照组
|
10
|
4.858�0.803*
|
7.577�1.045*
|
|
罗格列酮组
|
10
|
2.929�0.416△
|
5.977�0.852△
|
|
化浊汤高剂量组
|
10
|
3.325�0.421△
|
6.684�0.968△△
|
|
化浊汤低剂量组
|
10
|
3.989�0.507△△
|
6.813�0.917▲
|
注：与空白对照组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01，△△P<0.05；与罗格列酮组比较▲P＞0.05
3.化浊颗粒对NAFLD大鼠FFA及TNF-α影响
由表3可以看出，模型组与空白组大鼠血清FFA及TNF-α均有显著性差异(P＜0.01)。治疗后化浊颗粒组，罗格列酮组与模型组血清FFA、TNF-α比较有显著性差异(P＜0.01)，说明各治疗组均能降低NAFLD大鼠血清FFA 、TNF-α水平；化浊颗粒低剂量组与罗格列酮组比较有显著性差异（P<0.01或P<0.05），化浊颗粒高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义（P>0.05），说明化浊颗粒高剂量组与罗格列酮作用相似，均优于化浊颗粒低剂量组。
表3各组大鼠间FFA、TNF-α的比较（ �s）
|
组别
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动物数
（N）
|
游离脂肪酸
（FFA，μmol/L）
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肿瘤坏死因子
(TNF-α，ng/L)
|
|
空白对照组
|
8
|
5.0658E2�98.017
|
0.793�0.109
|
|
模型对照组
|
10
|
8.3501E2�76.179*
|
1.828�0.127*
|
|
罗格列酮组
|
10
|
5.4911E2�50.821△
|
1.039�0.147△
|
|
化浊颗粒高剂量组
|
10
|
5.7948E2�95.144△
|
1.166�0.128△
|
|
化浊颗粒低剂量组
|
10
|
6.6029E2�104.834△▲▲
|
1.436�0.246△▲
|
注：与空白组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01；与罗格列酮组比较▲P<0.01，▲▲P<0.05
4.化浊颗粒对NAFLD大鼠FINS及IRI（HOMA-IR）的影响
由表4可以看出，大鼠经造模后，模型组与空白组大鼠血清FINS及IRI值相比均有显著性差异（P＜0.01），而FPG无统计学意义（P>0.05）。治疗后，罗格列酮组、化浊颗粒高、低剂量组与模型组相比有显著性差异（P＜0.01），说明化浊颗粒组与罗格列酮组均能够降低大鼠FINS和IRI。化浊颗粒高剂量组与罗格列酮组血清FINS及IRI比较无统计学意义（P＞0.05），化浊颗粒低剂量组与罗格列酮组血清FINS及IRI比较有显著性差异（P＜0.01），说明化浊颗粒高剂量组与罗格列酮组治疗效果相当，均优于化浊颗粒低剂量组。
表4 各组大鼠间FINS、IRI的比较（ �s）
|
组别
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动物数
（N）
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FINS
(uIU/mL)
|
FPG
(mmol/L)
|
IRI（HOMA-IR）
|
|
空白对照组
|
8
|
6.928�0.963
|
4.510�0.357
|
1.398�0.248
|
|
模型对照组
|
10
|
16.493�0.733*
|
4.553�0.584
|
3.344�0.363*
|
|
罗格列酮组
|
10
|
11.046�1.059△
|
4.756�0.362
|
2.335�0.182△
|
|
化浊颗粒高剂量组
|
10
|
11.515�1.722△
|
4.715�0.434
|
2.410�0.321△
|
|
化浊颗粒低剂量组
|
8
|
13.170�3.328△▲
|
4.848�0.393
|
2.860�0.391△▲
|
注：与空白组比较*P<0.01；与模型组比较△P<0.01；与罗格列酮组比较▲P<0.01。
5.化浊颗粒对NAFLD大鼠肝细胞脂肪变性的影响
大鼠肝脏组织HE染色，高倍镜下观察可知：空白组大鼠肝脏呈暗红色，体积稍增大，组织切片表现肝索排列整齐，肝细胞胞浆红染；模型组大鼠肝脏体积增大，薄膜紧张，边缘圆钝，呈奶黄色，有油腻感，组织切片表现脂肪变性的肝细胞肿胀呈圆形，胞浆内出现大小不等的脂肪空泡，肝索排列不整齐，在靠近小叶边缘较明显。化浊颗粒高、低剂量组与罗格列酮组大鼠肝脏呈淡红色，体积增大，组织切片表现肝索排列整齐，肝小叶周围有散在脂肪空泡。
三、讨论
1.化浊颗粒对非酒精性脂肪肝病大鼠体重及肝指数的影响
肥胖是NAFLD的重要表现和病理因素，肝细胞脂肪变性、肝脏肿大是NAFLD的病理表现，减轻体重，消除肥胖，改善脂肪变性、减轻肝脏肿大是预防和治疗非酒精性脂肪肝的重要手段。
本实验表明：化浊颗粒大剂量组对非酒精性脂肪肝病大鼠的体重有减轻作用；罗格列酮组，化浊颗粒大、小剂量组均对非酒精性脂肪肝病大鼠肝指数有降低作用；与罗格列酮组比较，化浊颗粒大剂量组无统计学意义（P>0.05），说明化浊颗粒大剂量组在降低非酒精性脂肪肝病大鼠肝指数上的作用与罗格列酮相当。
2.化浊颗粒对非酒精性脂肪肝病大鼠血脂的影响
血脂异常是引起NAFLD产生和发展的主要原因。目前普遍认为脂肪肝的发病机制主要为：(1)进入肝内的脂肪酸过多，TG的合成超过将其转运出肝脏的能力；(2)肝内脂肪酸β氧化障碍，肝内脂肪酸利用减少，TG合成增加；(3)肝脏合成TG能力增强及脂蛋白代谢酶的活性下降[4]。由于上述原因致使过多的脂肪酸在肝细胞内沉积，从而造成肝细胞脂肪变性。
本实验表明：各组药物均能有效降低TG、TC水平，化浊颗粒大剂量组与罗格列酮作用相仿（P>0.05）。在降低TG方面，化浊颗粒小剂量组作用不及化浊颗粒大剂量组及罗格列酮组。中药制剂纯度及剂型方面有待于进一步的提高，以发挥更好的降糖效果。化浊颗粒与罗格列酮都可改善非酒精性脂肪肝病大鼠的脂代谢紊乱。罗格列酮的作用机理为通过激活脂肪组织PPAR-γ，减少游离脂肪酸的形成，最终导致TG合成减少。结合有关研究推测，化浊颗粒的作用机理可能为减轻肝脏细胞脂肪变性，改善肝脏功能，提高肝脏分解TG、TC的能力。
3.化浊颗粒对非酒精性脂肪肝病大鼠FFA及TNF-α的影响
近年来的相关研究表明：FFA与TNF-α互相促进,引起肝脏脂质蓄积、胰岛素抵抗，从而影响和加重NAFLD的发生发展。
本实验表明：化浊颗粒大剂量组对大鼠FFA与TNF-α的影响有和罗格列酮相似的作用，而化浊颗粒小剂量组的作用较差。
4.化浊颗粒对非酒精性脂肪肝病大鼠FPG、FINS及IRI的影响
近年研究发现几乎所有的NAFLD患者均伴有IR，FPG和FINS升高是IR的中间产物，同时也是IR的外在表现。我们用FPG和FINS的乘积除以22.5所计算出来的IRI是反映IR的一种方式。以这种方式计算出来的IRI与IR成正比例关系。
从实验可以看出，化浊颗粒与罗格列酮组均能够降低空腹血清胰岛素和空腹血糖，降低胰岛素抵抗指数。在降低大鼠空腹血清胰岛素及改善胰岛素抵抗方面，化浊颗粒大剂量组与罗格列酮组有相似的治疗效果；在降低空腹血糖方面，化浊颗粒大、小剂量组作用略差于罗格列酮组。说明化浊颗粒和罗格列酮都可以改善胰岛素抵抗[5]。结合有关研究推测，化浊颗粒改善胰岛素抵抗可能是降低FPG和FINS，降低FFA与TNF-α，调节血糖及调节脂代谢紊乱等综合因素所致。
5.化浊颗粒对非酒精性脂肪肝病大鼠肝细胞脂肪变性的影响
肝细胞脂肪变性是临床诊断非酒精性脂肪肝病的金标准。
本实验表明：化浊颗粒和罗格列酮均能在一定程度上改善肝细胞脂肪变性。从而对非酒精性脂肪肝病起到一定的治疗效果。胰岛素抵抗（IR）既能引起非酒精性脂肪肝病的发生，又能引起糖尿病的发生。积极治疗非酒精性脂肪肝病伴IR，但尚未诊断糖尿病的患者，防止其糖尿病的发生，这正好体现了中医的治未病与已病早治的思想，开展本药对这个人群的实验和临床研究，将有深远的意义。
参 考 文 献
[1] MarchesiniG，BugiansiE，ForlaniG，et cd. Nonalcoholic fatty liver steatohepatitis，and the metabolic syndrome[J]. Hepatology, 2003, 23（9）:17-23.
[2] HanleyAJ，W illiam sK， Festa A, et a1. Livermarkers an d develop-ment of 24 themetabolic syndrome: the insulin resistance atherosclero-sis study[J].Diabetes，2005，54(11): 3140.
[3] 徐正捷，范建高，王国良，丁晓东，田丽艳，郑晓英.高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型.世界华人消化杂志2002；10：392-396.
[4] 赵晓威.脂肪肝诊断和治疗研究进展[J].中医杂志, 2002, 43(12): 944.
[5] 赵文慧，韩德五，苗宇船等. 胰岛素抵抗在非酒精性脂肪肝发病中的作用[J].山西医科大学学报，2008，39（6）:500-503.
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